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Science子刊:麻省理工科学家发现“升级版”Cas9酶,限制性更低,能靶向几乎一半的基因组区域丨医麦猛爆料

· 医麦猛爆料

CRISPR基因组编辑系统已成为医学研究中非常重要的工具,并最终可能在农业、生物能源和粮食安全等领域产生重大影响。然而,尽管基因编辑工具取得了相当大的成功,但CRISPR-Cas9在基因组上的编辑范围仍然有限

CRISPR-Cas9系统需要Cas9酶在引导RNA(gRNA)的指引下负责切割特定的DNA序列。 其中,Cas9酶依赖于靶位点侧翼的特定序列,称为原型间隔区相邻基序或PAM,以允许其识别靶位点。

例如,最广泛使用的Cas9酶— —酿脓链球菌(SpCas9)的PAM序列,需要靶位点下游的一个5'-NGG-3'基序,显著限制其可靶向的位置数量(大约是基因组上约9.9%的位点)。

近日,麻省理工学院的科学家开发了更通用的CRISPR系统,一种PAM限制性要求更低的“升级版”Cas9酶,能靶向几乎一半的基因组序列,显著扩大了CRISPR的应用潜力。该研究于10月24日刊登在Science Advance上。

从左到右:Joseph Jacobson、Pranam Chatterjee、Noah Jakimo(图片来源:MIT)

领导这项研究的Joseph Jacobson博士说:“CRISPR就像一个非常准确和高效的邮政系统,只要邮政编码以零结尾,你就可以到达想要去的任何地方。因此它非常准确和具体,但同时也限制了你可以去的地点数量。”

ScCas9:由自然进化而来

为了开发更通用的CRISPR系统,研究人员利用了计算算法来对细菌序列进行生物信息学检索,以确定是否存在任何类似的Cas9酶,对PAM限制性要求较低。为了进行搜索,研究人员还开发了一种数据分析软件工具,他们称之为SPAMALOT(通过目标对齐搜索PAM)。

在此之前,虽然科学家们已经对许多Cas9同源物进行了测序,但只有屈指可数的链球菌直系同源物被鉴定或功能验证。

本次研究中,来自犬链球菌(S. canis)的Cas9酶(ScCas9)脱颖而出。ScCas9是一种高度相似的SpCas9直向同源物,与已经广泛使用的SpCas9酶非常相似,但它能够靶向其不能到达的基因位点。

限制性更低

研究人员通过使用ScCas9与SpCas9,以及针对具有不同PAM序列的天然基因组基因座(VEGFA)的sgRNA共转染人胚胎肾-293T细胞(HEK293T),来比较它们在人细胞中的PAM特异性。

检测到的基因修饰率证明

  • 在含有重叠5'-GGGT-3'PAM的目标位点上,SpCas9和ScCas9具有相当的编辑活性

  • SpCas9的切割活性在其他非5'-NGG-3'序列中受损

  • ScCas9在含有各种非重叠5'-NNGN-3'PAM序列的所有测试靶标上保持与SpCas9在5'-NGG-3'靶标上的相当活性

进一步的研究发现,在所有含5'-NNGN-3'PAM序列的目标位点中,ScCas9-ABE单碱基编辑系统也有显著的碱基编辑效率

人体细胞中ScCas9和SpCas9 PAM的特异性

总之,ScCas9可以作为SpCas9用于哺乳动物细胞中的基因组编辑的有效替代物,它对共有的5'-NGG-3'和5'-NNGN-3'PAM序列都具有亲和力

这意味着,新的CRISPR系统能在基因组上开辟更多的位置,允许其靶向许多先前已经超出系统范围的疾病特异性突变。

例如,一个典型的基因长度约为1000个碱基,如果他们的目的是简单地敲除整个基因,研究人员可以找到许多不同的定位点(PAM序列)。然而,许多疾病,例如镰状细胞性贫血,是由单一碱基的突变引起的,使得它们更难以靶向。

准确性显著提高

研究人员对先前报道的3个SpCas9高频脱靶位点进行分析,以评估SpCas9和ScCas9对它们的修饰活性。

与先前报道的数据一致,SpCas9在所有3个检查目标上显示出高的直接靶向。

ScCas9显示3种靶标的靶向活性相当,但在其中2个位点(VEGFA位点3和DNMT1位点4)上的脱靶活性可忽略不计,而在另一个位点(FANCF位点2)的脱靶比率降低近1.5倍

结果表明:在两者共有的5'-NGG-3'靶标上,ScCas9的基因编辑准确性显著提高

脱靶效率的比较

 
有望成为新一代基因编辑工具

ScCas9是基础版SpCas9的变体,两者的氨基酸序列非常相似,因此预期它也很容易以重组蛋白的形式进行生产,并且可以直接受益于现在SpCas9的所有开发流程。

此外,ScCas9使用与SpCas9相同的gRNA,因此可以在目前已有的不同公司购买合成gRNA。

Jacobson表示,希望利用他们的技术能够找到进一步扩展CRISPR系统靶向范围、并且不会降低其准确性的其他酶,从而能够追踪基因组上的每个地址

今年2月,CRISPR领域“大神”David R. Liu的团队通过改造,获得了xCas9— —可以广泛识别多种PAM序列(包括NG、GAA和GAT),编辑范围至少增加了4倍,可以靶向编辑基因组的1/4区域。

Jacobson等人表示,ScCas9扩展了目前使用的Cas9酶的基因靶向范围。随着进一步的发展,预计ScCas9和其他具有扩展靶向范围的Cas9直向同源物会扩大链球菌Cas9工具包,增强当前的CRISPR系统。

参考出处:

http://news.mit.edu/2018/new-crispr-tool-opens-genome-editing-1024

http://advances.sciencemag.org/content/4/10/eaau0766

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