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Nature重磅:上千次测试!科学家终于找到了更快、更便宜、更精确,不依赖病毒的T细胞工程化方法丨医麦猛爆料

· 医麦猛爆料

有史以来第一次,科学家们终于找到了一种可以有效、精确地从免疫系统的T细胞中去除基因并插入外源正常基因的方法,而且更重要的是,这种操作所需的时间比通过病毒载体进行基因递送的时间短得多。

专家表示,如果该技术可以在其他实验室中复制,那么它可能为治疗一系列疾病开辟了新的可能性,包括癌症,HIV感染,狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫疾病。相关的研究结果于2018年7月11日发表在《Nature》杂志上,宾夕法尼亚大学免疫学研究所主任John Wherry博士对此评价到:“这是一项重大进展”。

病毒载体制造瓶颈

众所周知,病毒在感染时可以有效地将其遗传物质引入靶细胞,并依赖宿主细胞进行复制。自20世纪70年代以来,科学家们便利用这种能力,剥离病毒传染特性,使用其产生的“病毒载体”将DNA递送到细胞中去以达到基因治疗的目的,而且近年来发展迅猛的CAR-T细胞疗法也是基于病毒载体对T细胞进行工程化设计的,这种递送系统是包括CAR-T在内的许多形式的基因治疗的核心。

现如今,这种CAR-T细胞产品已经被FDA批准上市。毫不夸张的说,没有病毒载体,就没有这种突破性疗法,但制造这种病毒是一项艰苦而昂贵的过程,临床级病毒载体的短缺导致了基因疗法和基于细胞的疗法的制造瓶颈。宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的基因治疗项目负责人James M. Wilson在接受纽约时报采访时,曾表示新病毒的等待时间可能长达数年

而且即使可用,病毒载体也远非理想的方式,因为它们将基因随意插入细胞基因组中,可能会损害现有的健康基因,或者保留新引入的基因,这些基因不受确保细胞正常运作的调节机制的影响,可能会导致严重的副作用。

因此,目前美国FDA要求对接受过病毒式转导T细胞的患者进行15年的随访。

如果不用病毒载体递送基因呢?事实上,在不使用病毒的情况下设计T细胞的想法并不新鲜,但免疫细胞很脆弱,很难在实验室中保持活力,而将所需基因导入细胞中更是难上加难。

新技术到底有何过人之处呢?

Nature中描述的新方法提供了一种强大的分子“切割和粘贴”系统,用于重写人类T细胞中的基因组序列。它依赖于电穿孔,是一种将电场施加到细胞上使其膜暂时更具渗透性的过程。在一年内试验了数千个变量之后,加州大学旧金山分校(UCSF)的研究人员发现:

当一定数量的T细胞,DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在适当的电场中时,T细胞将会在吸收这些元素,精确地将特定的基因序列整合到基因组中的CRISPR编程位点。

作为论文通讯作者,UCSF的 Alex Marson博士表示:这是一种快速,灵活的方法,可用于改变、增强和重新编程T细胞,因此我们可以用这种方法实现我们想要的特异性,以消除癌症,识别感染,或者遏制自身免疫性疾病中出现的过度免疫反应。换句话说,现在我们已经赢在了这条战线的起点上。

但同样重要的是新技术的速度和易用性,Marson表示:“这种方法可以将大量的DNA插入到T细胞中,赋予了细胞强大的新属性。而在此之前,Marson实验室的成员使用电穿孔和CRISPR将一些遗传物质插入到T细胞中已经取得了一些成功,但直到现在,许多研究人员多次尝试将长序列的DNA置于T细胞中,通常都会导致大多数细胞死亡,因此大多数人认为大型DNA序列对T细胞的毒性太大。

Theo Roth博士是论文的第一作者,他设计并领导了这项研究。他表示,尝试将新基因导入T细胞已经有三十年的研究历史了,现在,我们不在需要六七个人在实验室里使用病毒来设计T细胞了。在这种需求越来越大,所需要导入的DNA序列越来越复杂的环境中,我们需要的是尝试更多的可能性,推动下一代细胞疗法的快速发展。

经过近一年的反复试验,Roth确定了T细胞群,DNA量和CRISPR丰度的比例,结合使用适当参数传递的电场,可以有效且准确地对T细胞基因组进行编辑。为了验证这些发现,Roth指示CRISPR用绿色荧光蛋白(GFP)标记一系列不同的T细胞蛋白,结果表明:这种操作是高度特异性的,脱靶的几率非常低。

然后,在补充实验中,Roth,Marson及其同事展示了这项新技术用于整合T细胞对抗自身免疫性疾病或癌症的潜力。

自身免疫性疾病

在第一个例子中,Roth及其同事使用耶鲁大学医学院Kevan Herold博士提供给Marson实验室的T细胞。这些细胞来自三个患有罕见、严重的自身免疫性疾病的兄弟姐妹,迄今为止一直对治疗抵抗力。基因组测序显示这些儿童的T细胞携带一种名为IL2RA的基因突变该基因带有细胞表面受体的指令,这些细胞表面受体对于调节T细胞或Tregs的发育是必需的,其可以控制其他免疫细胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技术修复IL2RA缺陷(图片来源 nature)

实验结果表明:利用非病毒CRISPR技术,UCSF团队能够快速修复儿童T细胞中的IL2RA缺陷,并恢复受突变影响的细胞信号。在CAR-T治疗中,患者自身的T细胞被设计为具有强抗癌能力的CAR-T,然后回输到体内以靶向肿瘤,研究人员希望类似的方法也可以有效治疗Tregs出现故障的自身免疫性疾病。

抗癌潜力

在与加州大学洛杉矶分校Parker癌症免疫疗法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作进行的第二组实验中,科学家们完全取代了正常人类T细胞群中的天然T细胞受体,专门设计了用于寻找人类黑色素瘤细胞的特定亚型的新受体。其中T细胞受体是细胞用于检测疾病或感染的传感器,在实验室培养中,工程化细胞有效地归巢于靶向黑素瘤细胞而忽略其他细胞,表现出了高度的特异性

非病毒工程化的人T细胞进入肿瘤部位并显示出抗癌活性(图片来源 nature)

实验结果表明:在不使用病毒的情况下,研究人员能够生成大量经过重新编程的CRISPR工程化细胞,表达出新的T细胞受体。当转移到植入人黑素瘤肿瘤的小鼠中时,工程化的人T细胞进入肿瘤部位并显示出抗癌活性。

Marson说“这种替代T细胞受体的策略可以推广到任何T细胞受体,通过这种新技术,我们可以剪切并粘贴到指定的位置,重写基因组序列中的特定页面。”

HIV感染

另外,Wherry博士还表示,这项技术对治疗HIV也很有希望。HIV病毒感染T细胞,如果它们可以经过工程化设计,使得病毒不能进入T细胞,那么感染HIV的人,就不会进展到艾滋病。那些已被感染的T细胞会死亡,而工程化细胞会取而代之。虽然先前已有研究表明,通过这种方式有可能治疗HIV。但现在有了一个非常有效的新方法来做到这一点。

由于新技术可以在差不多一周的时间内创建可行的定制T细胞系,因此它已经改变了Marson实验室的研究环境。由于病毒载体带来的障碍,之前认为过于困难或昂贵的实验的想法现在已经可以进行了。Roth表示,他们将研究20个'疯狂'的想法,因为可以非常快速地创建CRISPR模板,而一旦有了模板,他们就可以将它放入T细胞并快速生长。”

功夫不负有心人:Marson博士将新方法的成功归功于Roth的“绝对坚持”,面对人们普遍认为病毒载体是必需的,并且T细胞只能容忍小片段DNA。 Roth确信能够找到合适的条件来克服这些明显的局限性,并且他付出了巨大努力来测试数千种不同的条件:CRISPR与DNA的比例;细胞培养的不同方式;不同的电流。通过优化每个参数并将最佳条件放在一起,最终他得到了这个惊人的结果。

目前,科学家们正在与美国FDA讨论如何使用新方法精确攻击实体肿瘤以及血血液肿瘤,希望能够尽快推动这一技术应用。

参考出处:

https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5

https://www.ucsf.edu/news/2018/07/411071/t-cell-engineering-breakthrough-sidesteps-need-viruses-gene-editing

https://www.washingtonpost.com/news/speaking-of-science/wp/2018/07/11/with-new-genes-and-an-electric-shock-scientists-turn-immune-cells-against-cancer/?noredirect=on&utm_term=.8961e28cf9ff

https://www.nytimes.com/2018/07/11/health/gene-editing-cancer.html

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